检测方法：如何通过考马斯亮蓝染色法测定植物可溶性蛋白

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可溶性可以以小分子状态溶于水或其他溶剂的蛋白。通常在植物生理、微生物、食品加工等实验中作为重要指标。蛋白是

植物抗旱性

的重要指标之一。今天栢晖生物就给大家分享一下如何通过

考马斯亮蓝染色法测定植物中的可溶性蛋白：

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所有试剂除注明者外，均为分析纯。

1.1 考马斯亮蓝溶液配制

：称取100 mg考马斯亮蓝，溶于50ml 90%乙醇中，加入100ml 85%（W/V）磷酸，再用蒸馏水定容到1L。在过夜后过滤并贮于棕色瓶中，常温下可保存一个月。

1.2 90% 乙醇

1.3 100 g/ml 牛血清蛋白（BSA）标准溶液

：称取10mg BSA定容至100 ml即为100 g/ml。或称取25 mg BSA加蒸馏水水溶解后定容至100 ml，再从中吸取40 ml蒸馏水定容至100ml。

1.4 0.05 mol/LpH7.8磷酸配制

：

A母液，0.2 mol/L磷酸氢二钠溶液：取Na2HPO4·12H2O (分子量358.14)35.85 g，用蒸馏水定容至500 ml。

B母液，0.2 mol/L磷酸二氢钠溶液：取NaH2PO4·2H2O (分子量156.01)1.5601 g，用蒸馏水定容到50 ml。

1.5 0.05M pH7.8磷酸

：分别取A母液228.75ml，B母液21.25ml，用蒸馏水定容至1000ml。

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万分之一分析天平、紫外可见分光光度计、离心机

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取风干的实验室待测样品充分混匀后，籽粒全部通过 0.25mm（秸秆通过 0.5mm）孔径筛，装入样品瓶备用。

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4.1 试样溶液制备

样品提取：取鲜样0.2—0.5g，用蒸馏水或缓冲液研磨成匀浆后，3000r/min—4000r/min离心10min，上清液备用。

4.2 标准曲线绘制

取6支具塞试管，依次加入标液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml，然后用蒸馏水补充至1ml，再向各管中加入5ml考马斯亮蓝试剂，5min左右，以0号试管为空白对照，在595nm下比色测定吸光度，以蛋白质含量为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线。

4.3 样品的测定

吸取样品提取液1.0ml（视蛋白质含量适当稀释），放入试管中（每个样品重复两次），加入5ml考马斯亮蓝试剂，摇匀，放置2min待反应完成，在595nm下比色，测定吸光度，并通过标准曲线查蛋白质含量。

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式中：

C—查标准曲线值，g；

Vt—提取液总体积，ml；

WF—样品鲜重，g；

Vs—测定时加样量，ml

所得结果应保留小数点后三位

来源：成都栢晖生物整理

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